X
تبلیغات
Rezafalak

Cell Culture Overview

 

Sources of cells:

1. Primary culture-cells are obtained directly from animal tissue. Typically, the tissue is mechanically separated into small pieces, digested with one or more enzymes (Trypsin, Collagenase, Papain, Dispase), separated from the digestion mix, then plated on an appropriate substrate. Different substrata and culture conditions can be used to specifically enhance the growth of particular cell types.

2. Commercial laboratories (e.g. ATCC) offer a variety of cell lines from many types of tissues. Cell lines are homogenous populations of cells that have been maintained in culture and are well characterized. Normal cells maintained in culture have a finite life span and eventually reach a point termed crisis at which the cells either die or are spontaneously transformed as a result of random mutations. Commercial laboratories also offer a variety of transformed (also known as continuous or immortalized) cell lines, which proliferate in culture indefinitely. Clonal cell lines are also available which are derived from a single cell isolated from a population.

 

The Cell Culture Environment:

 

Substrate: Most normal cell lines are anchorage-dependent, meaning that they require a substrate suitable for adhesion in order to survive and proliferate. Cells are typically grown on tissue culture polystyrene (polystyrene modified through various types of plasma discharge for optimal cell adhesion) in either T-flasks or multi-well plates. Cells also grow well on glass and a variety of other polymers treated with extracellular matrix proteins or a positively charged polymer such as poly-L-lysine.

 

Medium: Cells are grown in an aqueous nutrient medium which consists primarily of water, glucose, amino acids, vitamins, inorganic salts, antibiotics and other micronutrients depending on the cell type. Cell culture medium is balanced to provide an appropriate osmolarity comparable to physiological conditions. Most cells are grown in DMEM. This is an abbreviation for Dulbecco / Vogt modified

Eagle's (Harry Eagle) minimal essential medium. A few lymphoid cell lines are grown in RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium.). Cells grown in DMEM must be grown in a 10% CO2 atmosphere. In contrast, cells grown in RPMI must be grown in a 5% CO2 atmosphere. If you grow cells in RPMI in 10% CO2, the medium will be too acidic (yellow). DMEM differs from the original MEM in that it contains approximately 4 times as much of the vitamins and amino acids present in the original formula, and some (2 to 4 fold) more glucose. It also contains iron and a few other oddments. Most kinds of cells (human, monkey, hamster, rat, mouse, chicken) grow well in this medium.

 

Buffering / Gas Phase: Medium must also be buffered in order to maintain the pH within the physiological range (pH 7.0-7.4). Most cell culture mediums are buffered with sodium bicarbonate and therefore must be maintained under a carbon dioxide containing gas phase. A synthetic buffer, HEPES, is also available which can buffer medium under normal atmospheric conditions.

 

Serum/growth factors: Cells are usually grown in either serum containing medium or chemically defined medium. Serum containing medium is most widely used with established cell lines. Serum contains a variety of growth factors that stimulate cell division, adhesive proteins such as fibronectin and vitronectin, which mediate cell adhesion to the substrate, and numerous other proteins (particularly hormones), which may assist in cell survival. The disadvantage of serum-based culture is that the protein composition of serum is extremely complex and may vary between batches, making it impossible to know precisely what is in the medium. Chemically defined medium is prepared without serum using purified or recombinant growth factors, adhesive proteins, and hormones.

 

Incubation: Cell culture vessels must be stored in an incubator at 35-37 o C.

 

Sterility: The success of cell culture depends on maintaining a sterile environment when working with cells. Bacteria, protozoa, fungi, and mycoplasma grow well in cell culture medium. These microorganisms have much faster division rates than mammalian cells and will rapidly overtake cultures if they are present. Therefore, sterile conditions must be maintained using a variety of equipment. Cell culture work is typically performed under a laminar flow hood, which provides a constant stream of sterile, filtered air over the working area. The laminar flow or biological safety hood must be appropriate to the hazardous nature of the project. Most commercial laminar flow hoods contain a UV light source that is turned on for 15-30 minutes prior to working in the hood. Most cell culture equipment is purchased sterile from the manufacturer (media, pipettes, culture vessels, serum). Materials to be reused can be sterilized by autoclaving and solutions may be filtered through a 0.22 micron filter into a sterile container. Sometimes medium is supplemented with antibiotics to minimize the chance of infection. Countertops in the laboratory are generally cleaned by wiping with 70% isopropyl alcohol.

 

Contamination: Most students beginning cell culture usually assume any unidentifiable particle in their cultures to be contamination. However, medium and serum precipitates and normal cell debris account for most particles seen in culture. In general, a contaminated culture is rapidly overtaken with countless particles. Also, the presence of microbial contamination usually results in a rapid decrease in pH. However, mycoplasma contamination cannot be detected visually. Therefore, cells should be routinely screened using a DNA binding dye (Hoechst 33258 for example) to check for mycoplasma contamination.

 

 

Problems with cell culture:

Cell culture is frequently used as an economical model of in vivo conditions for research and also for initial clinical testing of many drugs. Although cell culture has many advantages, there are some significant differences from in vivo conditions that should not be overlooked.

 

Loss of three-dimensional shape: Cells cultured on traditional substrates such as tissue culture polystyrene obtain a flattened, well-spread morphology on their two-dimensional growth substrate, losing any type of physiological three-dimensional structure and polarity. Three dimensional culture substrates such as collagen gels, and synthetic polymers are now available to reduce this problem.

 

Homogeneity: This property of cell culture is advantageous in many ways but also a liability. After being placed in culture, cells undergo a selective process in which those most suited for survival in culture proliferate while others die. Over time, this leads to the generation of a relatively uniform population, which although useful for providing ease of reproducibility in culture experiments, is quite different from in vivo conditions. Cells in culture are also deprived of heterotypic interactions with other cells types.

 

Dedifferentiation: Once placed in culture, cells also rapidly lose many of their differentiated functions. Epithelial cells lose their polarity; hepatocytes dramatically down regulate synthesis of liver specific proteins, etc. Again, the development of new culture substrates is addressing this problem.

 

Energy metabolism: Cells in culture rely almost exclusively on glycolysis for energy.

 

 

Cell Culture Laboratory Exercise:

 

Equipment:

1.     Laminar flow hood

2.     CO2 Incubator

3.     Mechanical Pipettor

4.     Inverted microscope

5.     Vacuum pump

 

Materials:

1.     Complete cell culture medium, appropriate for the cell line

2.     Tissue culture flasks of appropriate sizes

3.     Tissue culture plates - 96 well or 24 well.

4.     Sterile pipets, assorted sizes

5.     Multichannel pipet and sterile tips.

6.     Sterile Pasteur pipettes

7.     70% ethanol

8.     Sterile Petri dishes.

 

Pre-operation procedure:

1.    Carry out all items inside a laminar flow hood.

2.     Turn UV lamp on 15 min prior to working in hood (turn off before working in hood)

3.    Turn on the hood and allow to run for at least 10 minutes before starting.

4.    Pre-warm all media in 37oC water bath.

5.     Disinfect all surfaces prior to use with a disinfectant solution.

6.    Swab down the working surface with 70% ethanol (or Isopropanol).

7.     Periodically spread a solution of 70% ethanol over the exterior of gloves to minimize contamination. 5. In case of any spill, spread a solution of 70% alcohol and swab immediately.

8.     Discard gloves after use. Replace them if torn.

9.     Bring into the work area only those items needed for a particular procedure.

10.                       Leave a wide clear space in the center of the hood (not just the front edge) to work on. Do not clutter the area to prevent blockage of proper airflow and to minimize turbulence.

11.                       Swab with 70% alcohol all glassware (medium bottles, beakers, etc.) before placing them inside the hood.

12.                       Arrange the work area to have easy access to all of it without having to reach over one item to get at another (especially over an open bottle or flask).

13.                       Use sterile wrapped pipettes and discard them after use into a biohazard waste container.

14.                       Check that the wrapping of the sterile pipette is not broken or damaged.

15.                       Inspect the vessels to be used: They must be free from visible contamination or breakage, or lack container identification. The plastic covering the flask must be intact. Check expiration dates on media.

16.                       Discard any biohazard or contaminated material immediately.

17.                       When handling sterile containers with caps or lids, place the cap on its side if it must be laid on the work surface.

18.                       Make sure not to touch the tip of the pipette to the rim of any flask or sterile bottle.

19.                       Clean the work area when finished by wiping with 70% alcohol.

 

Operation procedure overview:

1. Prepare cell culture medium (Bring to 37 oC, verify sterility)

2. Thaw vials of Dermal Fibroblasts and initiate cultures.

3. Maintain (feed) during the week and subculture (passage) in 24 well plates for immunochemical analysis and other tests.

 

Culture medium preparation:

Dermal Fibroblasts are cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 10% bovine calf serum.

 

Cell Thawing:

For long-term storage, cells can be stored indefinitely in liquid nitrogen and prior to freezing a cryogenic agent such as DMSO or glycerol is added to the culture media.

Procedure:

1. Prepare a water bath at 37 o C.

2. Remove a vial of cells from liquid nitrogen and place immediately into water bath.

3. Once thawed (approximately 2-3 minutes) dry, spray with alcohol and place under laminar flow hood.

4. Pipette cells from vial and wash 3 times with culture medium. Re-suspend the pellet in 10 ml of culture medium place in a T-flask in incubator (37 o C, 10% CO2).

5. After 24 hours of incubation, remove the entire culture medium and replace with fresh medium.

 

Maintenance:

In order to obtain optimal growth, the cell culture medium is changed every other day (feeding cells). Growth factors in serum are rapidly used or become denatured and must be replaced. Dense and rapidly dividing cultures quickly use up the available glucose.

 

Subculturing:

Once cells cover most of the culture surface, a condition called confluence, they must be dissociated, diluted, and replanted in new vessels to maintain growth.

1. Remove culture medium from cells.

2. Add 0.25% Trypsin to disassociate cells. (2 ml for 25 cm2 flask, 3-4 ml for 75 cm2 flask)

3. Incubate for 10-15 minutes at 37 o C.

4. Mechanically loosen cells by giving a tap at the bottom of the flask, and then aspirating the solution.

5. Confirm that the cells have loosened under the microscope.

6. Transfer to centrifuge tube, centrifuge for 5 minutes at 1000 rpm.

7. Remove supernatant and resuspend pellet in 10 ml of culture medium. At this stage, the cell-density would be ~200,000 cells per ml.

8. Add 1 ml of this suspension to 9 ml of medium in another flask to continue culturing.

9. For Subculturing in 24-well plate, dilute this suspension 1/6 with medium to obtain an approximate cell-density of 33.333 cells per ml.

10. Add 300 ul of this diluted cell suspension to each well of the 24-well plate so that you have ~10,000 cells per well in the plate.

11. Cover and replace in incubator for use in immunology/biochemistry laboratory experiments.

 

 

+ نوشته شده در  Sat 15 Mar 2008ساعت 3 PM  توسط Reza Falak  | 

Protease Assay Methods

روشهای اندازه گیری پروتئازها

خلاصه مقاله:

پروتئازها کاربردهای مختلفی در پزشکی و صنعت دارند. این آنزیمها در فعالیتهای فیزیولوژیکی و پاتولوژیکی مهمی نقش دارند. لذا اندازه گیری پروتئازها و فعالیت آنها در مایعات بدن یا مایع روئی محیط کشت سلولی با ارزش است. از روشهای مختلف بیوشیمیائی، زایموگرافی و ایمونولوژیکی می توان برای تعیین مقدار یا فعالیت این آنزیمها استفاده کرد. انتخاب روش کار به نوع آنزیم و محل قرار گیری آن بستگی دارد. در این مقاله ضمن اشاره به اهمیت پروتئازها، روشهای مختلف اندازه گیری آنها مرور شده و محاسن هر یک از این روشها مورد بحث قرار می گیرد.

 

 

Abstract:

Proteases are very important in medicine and industry. They are involved in many physiological and pathological processes. Therefore evaluation of proteolytic enzymes and their activities in body fluids and supernatant of cultured cells is very useful. Several methods including biochemical, zymographic and immunological assays can be used to evaluate these enzymes and their activities. Selection of the method depends on enzyme type and its location. In this paper the importance of proteases and their assay methods will be reviewed and the benefits of each assay will be discussed.

 

بکار گیری پروتئازها در صنعت و معالجات پزشكي به صدها سال پيش برمي گردد. در آن زمان پروتئازهائی نظیر کلاژناز از قسمت دهاني كرمهاي زنده تهيه مي شدند و جراحان از اين پروتئازها براي تسريع بهبود زخم استفاده مي كردند. این آنزیمها بافتهای نکروتیک را تجزیه کرده ولی به بافت سالم آسیب نمی رسانند.  امروزه نیز متخصصین پوست بقایای پوست محل سوختگی یا بافت نکروز شده را با جراحی برداشته و سپس با استفاده از پروتئازها بستر مناسبی برای پیوند پوست ایجاد می کنند. پروتئازها در صنعت نیز استفاده های زيادي دارند. اغلب پودرهای شوینده حاوی پروتئازهای مختلف باکتریائی نظیر پروتئازهای باسیلوس سابتلیس و باسیلوس لایچینی فورمیس هستند که قادر به تحمل شرایط قلیائی و دمای حدود 65 درجه سانتی گراد بمدت 1-2 ساعت می باشند. اغلب این پروتئازها در داخل کپسولهائی قرار می گیرند که در اثر تماس با آب متورم شده و آنزیمهای خود را رها می کنند. همچنین از آنزیمهائی نظیر پاپائین که از شیرابه گیاه کاریکا پاپایا بدست می آید برای ترد کردن گوشت استفاده می شود. استفاده از تریپسین و کیموتریپسین در دباغی پوست گوسفند نیز سابقه دیرینه دارد. این آنزیمها به قاعده فولیکولهای مو نفوذ کرده و بدون تاثیر قابل توجهی بر روی پشم گوسفند باعث جدا شدن پشم از چرم می شوند(1-2-3). پروتئازها در آزمایشگاههای تحقیقاتی نیز کاربرد فراوانی دارند. مثلا در بيولوژي سلولی از آنزیم کلاژناز برای جداسازي سریع سلولها از بافت و از آنزیم تریپسین برای جدا شدن سلولهای چسبیده به کف پلیت کشت سلولی استفاده می شود(4).

پروتئازها با توجه به مكانيسم عملكرد به چهار خانواده سرين پروتئازها، متالوپروتئازها، آسپارتيك پروتئازها و سيستئين پروتئازها تقسيم مي شوند ولي تعداد معدودي از آنها هنوز در خانواده خاصي طبقه بندي نشده اند (5). در بعضی از بیماریها تعادل بین پروتئازها با مهار کننده های طبیعی آنها بهم خورده و موجب تخریب بافت یا تغییراتی در ساختمان بافت می گردد لذا ايجاد مهاركننده هاي اختصاصي اين آنزيمها جزء پروژه های مهم شركتهاي داروسازي مي باشد. پروتئازها در فرایندهائی فیزیولوژیک و پاتولوژیک متعددی نظیر التهابات، پاسخهای ایمنی، ترمیم زخم، متاستاز سرطان، آنوریسم و آمفیزم ریوی نقش دارند که بعضی از موارد مهم آن بصورت خلاصه در جدول زیر آمده است (3-9-21-26):

خانواده

آنزیم مهم

نقش مهم

سرين پروتئازها

الاستاز نوتروفيلي

آمفيزم ريوي

ترومبين

تشكيل لخته

دي پپتيديل پپتيداز IV

پاسخهاي ايمني

گرانزايم ها

پاسخهاي ايمني

متالوپروتئازها

آنزيم مبدل آنژيوتانسين

فشار خون

کلاژنازها

ترمیم زخم

ژلاتینازها

ترمیم زخم

استروميليزينها

التهابات بخصوص آرتريت روماتوئيد

الاستاز سودوموناس آيروژينوزا

عفونتهاي ريوي بخصوص فيبروز كيستيك

سيستئين پروتئازها

كاتپسين B

تومورها

كالپائين

آسیب بافت مغزي در اثر تروما

آسپارتيك پروتئازها

رنين

فشار خون

اندازه گيري پروتئازها:

در دهه گذشته توجه زيادي به اندازه گیری پروتئازها معطوف شده است (1-10) و روشهاي قديمي جاي خود را به روشها جديدتری داده اند، بطوريكه امروزه سعي بر آن است که این آزمونها بصورت مکانیزه انجام شوند. در اندازه گيري پروتئازها به مواردی نظیر خصوصيات سوبسترا، نوع آنزيم، ميزان فعاليت آنزيم و حساسيت روش كار بایستی توجه داشت. آنزيمها به روشهاي مختلفي از جمله ايمونواسي (نظير الايزا) قابل اندازه گيري هستند (11-12) ولي اندازه گيري فعاليت آنها يا اندازه گيري شكل فعال آنزيمها اهميت ويژه اي دارد. بطور كلي پروتئازها با تاثير بر روي سوبستراي اختصاصي خود موجب تجزيه آنها مي شوند. لذا با تعيين مقدار محصول در مقايسه با سوبستراي اوليه يا مقايسه ميزان محصول در مقابل يك استاندارد مي توان ميزان فعاليت آنها را تعيين نمود.

يكي از روشهاي اندازه گيري پروتئازها بررسی فعاليت آنزیمی بر روی سوبستراهاي طبيعي آنهاست. مثلاً رایج ترین سوبستراهاي طبيعي اندوپپتيدازها كازئين، هموگلوبين و ژلاتين هستند که ارزان قيمت بوده و بصورت خالص قابل تهيه می باشند. در صورتي كه آنزيم شناخته شده باشد مي توان مناسبترين سوبسترا را انتخاب نمود. مثلاً براي كلاژناز بهترين سوبسترا كلاژن است. در صورتي كه نوع آنزيم ناشناخته باشد، جستجوي سوبستراي مناسب بسيار مهم است (10-13).

براي بررسي ابتدائي فعاليت پروتئولايتيك از یک آزمايش ساده و عمومي استفاده مي شود. در این آزمایش به محلول سوبسترا که عمدتا كازئين يا هموگلوبين می باشد مایع آنزیمی مورد نظر را افزوده و پس از انکوباسیون به محلول واکنش اسيد تري كلرواستيك پنج درصد اضافه می شود تا واکنش متوقف شده و سوبستراهای تجزیه نشده دناتوره شده و از محیط واکنش خارج شوند. سپس مایع فوق سانتریفیوژ شده و جذب نوري مايع روئي در280 نانومتر در مقابل بلانك قرائت می شود. میزان فعالیت آنزیمی با جذب نوری نسبت مستقیم داشته و متناسب با میزان سوبسترا های تجزیه شده ای می باشد که بعلت کوچک بودن اندازه با اسید تری کلرواستیک واکنش نداده اند (10).

روش ديگر اندازه گيري فعاليت پروتئازي استفاده از رنگ كوماسي آبي است. اين رنگ تمايل به اتصال به پلي پپتيدها دارد لذا مي توان براي رنگ آميزي سوبستراهاي تجزيه نشده از این رنگ استفاده نمود. برای انجام این آزمایش به محلول کازئین محلول آنزيمي افزوده و پس از انکوباسیون کوماسی آبی اضافه می شود و ده دقيقه بعد جذب نوري در مقابل بلانك و كنترلهاي مناسب در طول موج 595 نانومتر قرائت می گردد.

يكي از روشهاي بررسي فعاليت پروتئازها استفاده از كروموفورها (مشتقات رنگی سوبستراهای پروتئینی) است. مهمترين كروموفورهايي كه بدين منظور بكار مي روند آزوكول (آزوژلاتينآزوكازئين و آزوآلبومين هستند این مواد در حقيقت ژلاتين، كازئين يا آلبومینی هستند كه يك ماده رنگي مخفي در ساختمان خود دارند. آزوكول سوبستراي مناسبي براي متالوپروتئازهايي نظير كلاژناز و ژلاتيناز است آزوكازئين سوبستراي مناسبي براي استروميليزينها و سرين پروتئازهايي مثل پلاسمين می باشد. استفاده از اين مشتقات بسيار ساده بوده و نتايج حاصل با ارزش است، زيرا وابسته به آزادسازي پپتيدهاي قرمز رنگ کوچکی است كه پس از توقف واکنش و رسوب دادن قطعات درشت تر آزوپروتئين توسط اسيد تري كلرواستيك ده درصد و سانتریفیوژ دور بالا، مي توان جذب نوري مايع روئي را در 440 نانومتر اندازه گرفت و فعالیت آنزیمی را محاسبه کرد. لذا روش كار بسيار ساده بوده و حتي با يك اسپكتروفتومتر ارزان قيمت قابل انجام است. براي افزايش حساسيت تست مي توان از كنژوگه هاي فلورسانس پلي پپتيدها استفاده كرد كه البته قرائت نتايج نياز به فلوريمتر دارد. تيوپپتوليد ماده ديگري است كه بسيار حساس تر از آزوكول و آزوكازئين بوده و براي متالوپروتئازها كاملا اختصاصي است. سرين پروتئازهايي نظير فعال كننده هاي پلاسمينوژن روي تيوپپتوليد تاثير ندارند ولي تمام متالوپروتئازها اثر كاملا مشابهي روي اين ماده دارند لذا در صورت استفاده از تیوپپتولید نمي توان گفت كه كدام متالوپروتئاز روي ماده فوق مؤثر بوده است (10-13-16).

يكي از روشهاي بررسي فعاليت پروتئازها زایموگرافی است (1-2-16). زایموگرافی به معنی مشاهده چشمی و کشیدن منحنی فعالیت آنزیمی توسط دانسیتومتر بوده و عمدتا جهت بررسی ماتریکس متالوپروتئازها بکار می رود. ماتریکس متالوپروتئازها در فرآيندهاي فيزيولوژيكي مختلفي نقش دارند که از آن جمله می توان به  فرآيندهاي توليد مثل، مهاجرت سلولی، مورفوژنز بافتهاي جنيني، آنژيوژنز و ترميم زخم اشاره کرد. اين آنزيمها در فرآيندهاي پاتولوژيك نيز مهم بوده و از عوامل مهم پاتوژنز آترواسكلروز، آنوريسم آئورت، آمفيزم ريوي، بولوس پمفيگوس، سرطان و متاستاز هستند (9).

ماتريكس متالوپروتئازها اغلب بصورت پروآنزيم ترشح شده و تحت تاثير پروتئازهاي ديگر فعال مي شوند. يكي از معروفترين متالوپروتئازها، كلاژناز يا ماتريكس متالوپروتئاز يك (MMP1) است. كلاژناز روي كلاژن نوع يك تاثير كرده و آن را به دو قسمت تقسيم مي نمايد كه با انجام SDS PAGE مي توان ميزان كلاژن تجزيه نشده و محصولات حاصل از تجزيه كلاژن را در مقايسه با مقدار اوليه سوبسترا تعيين نموده و فعاليت آنزيمي آن را محاسبه کرد.

ماتريكس متالوپروتئازهاي ديگري نظير ژلاتينازها و استروميليزين ها باعث تجزيه وسيعتر سوبستراي خود شده و در نتيجه  محصولات بسيار كوچكتري ايجاد مي كنند كه با SDS PAGE  قابل بررسي نيستند و برای تعيين فعاليت اين آنزيمها از زايموگرافي استفاده مي شود (1-16).

زايموگرافي در حقيقت نوع خاصي SDS PAGE است كه در طي آن ژل پلي آكريلاميد با سوبستراي آنزيم مورد نظر كوپليمريزه شده سپس الکتروفورز انجام مي شود. پس از اتمام كار ژل در بافري شستشو داده مي شود تا SDS از محيط خارج شود و آنزيم فعاليت اوليه خود را كسب نمايد. بطور کلی روش زايموگرافي براي بررسی متالوپروتئازهائي نظیر ژلاتينازها، استروميليزين ها و فعال كننده هاي پلاسمينوژن كه پس از دناتوره شدن (در اثر SDS PAGE) دوباره قادر به کسب شكل طبيعي خود هستند (RENATURE) قابل استفاده می باشد. در نهایت ژل در بافر حاوي كاتيونهاي لازم براي فعاليت متالوپروتئازها انكوبه مي شود تا آنزيم كه در ناحيه خاصي از ژل تجمع ياقته است روي سوبسترا اثر كند. اغلب پس از رنگ آميزي و رنگبري هاله هاي شفاف و بيرنگي ظاهر مي شود كه نشانگر فعاليت پروتئوليتك آنزيم بوده و بروش دانسيتومتري قابل اندازه گيري است. در صورتي كه از سوبستراي نشاندار شده با ماده راديواكتيو استفاده شود مي توان ژل را روي فيلم راديوگرافي قرار داده پس از مدتي فيلم راديوگرافي را بررسي كرد (16).

محاسن روش زايموگرافي: اين روش نسبت به ساير روشهاي اندازه گيري متالوپروتئازها مزایای ویژه اي داشته و كاربردهاي وسيعتري دارد:

1- با اين روش مي توان وزن مولکولي تقريبي آنزيم را تعيين نموده و نوع آنزيم را تعيين نمود. در مطالعات اوليه پروتئازها از سوبستراهاي عمومي تري مثل ژلاتين يا كازئين استفاده مي شود، ولي پس از تعيين نوع آنزيم مي توان سوبستراهاي اختصاصي تري را به كار گرفت. مثلا براي بررسي فعال كننده هاي پلاسمينوژن از كازئين و پلاسمينوژن بطور همزمان استفاده مي شود. پلاسمينوژن پس از فعال شدن و تبديل شدن به پلاسمين سبب تجزيه كازئين مي شود سپس ميزان فعاليت پروتئوليتيك پلاسمين روي كازئين سنجيده مي شود. براي بررسي الاستازها مي توان از كوپليمريزاسيون آلفا الاستين با ژل پلي آكريلاميد استفاده كرد. همچنين با اين روش مي توان آنزيمهايي نظير هيالورونيدازها را كه بخش كربوهيدراتي مولكولهاي ماتريكس را تخريب مي كنند بررسي نمود.

2- در اين روش اغلب پروآنزيم ها تحت تاثير SDS به صورت آنزيم فعال در مي آيند لذا فعالسازي اوليه جهت تبديل پروآنزيمها به آنزيم فعال ضروري نخواهد بود. برخلاف SDS PAGE معمولي در اين روش جهت جلوگيري از تخريب آنزيم از جوشاندن نمونه يا بكارگيري مواد احيا كننده خودداري شده و سيستم الكتروفورز به سيستم مبرد نيز مجهز مي گردد.

3- در اين روش مهار كننده هاي اختصاصي متالوپروتئازها (TIMPs) نيز كه ساختمان پروتئيني دارند از آن جدا شده و فعاليت آنزيم را مهار نمي كنند.

4- زايموگرافي حساسيت خوبي دارد و 10-1 ميكروليتر از مايع روي كشت سلولي يا عصاره حاصل از لیز سلولي براي آزمايش كافي است.

5- با تغيير سيستم  آزمايش مي توان مهار كننده هاي اختصاصي متالوپروتئازها را نيز با اين روش اندازه گيري نمود. براي اين كار طبق پروتوكل زايموگرافي عمل نموده و در مرحله نهائي پس از جدا شدن  SDS از ژل به جاي بافر زايموگرافي از بافري كه غني از پروتئازهاي خاص باشد استفاده مي شود. مثلا براي بررسي  TIMP1 و  TIMP2 ژل را در محيط كشت روئي فيبروبلاست كه به آن  4-آمینوفنیل مرکوریک اسید جهت فعال کردن متالوپروتئازها اضافه شده است انكوبه نموده  و پس از 8-1 ساعت ژل را رنگ آميزي نموده و سپس رنگ بري مي كنيم. پروتئينهاي موجود در قسمتهايي از ژل كه فاقد مهار كننده باشند توسط پروتئازهاي مايع روئي كشت تجزيه مي شوند لذا اين مناطق پس از رنگ آميزي ژل شفاف خواهند بود ولي سوبستراهای پروتئينی موجود در بخشهائي از ژل كه حاوي مهار كننده هاي اختصاصي پروتئازهاست تجزيه نشده و پس از رنگ آمیزی بصورت آبي رنگ ديده مي شوند.

6- با اين روش مي توان تاثير مهاركننده هاي مختلف دارويي را روي فعاليت آنزيم تعيين نموده و عوامل مهار كننده اين پروتئازها را مشخص نمود. يعني پس از اتمام الكتروفورز به بافر انكوباسيون مقدار مشخصي از ماده مهار كننده اضافه نموده و ميزان كاهش فعاليت پروتئازي را در مقايسه با فعاليت اوليه آنزيم مي سنجيم. بدين منظور يك نمونه در چند خط الكتروفورز شده و سپس اين خطوط بريده شده و هر كدام توسط مهار كننده خاصي مورد بررسي قرار مي گيرد از اين خصوصيت زايموگرافي مي توان جهت تعيين نوع آنزيم نيز استفاده كرد. از روش فوق براي بررسي مهار كننده هاي اختصاصي فعال كننده هاي پلاسمينوژن (PAI1 و PAI2) نيز مي توان استفاده كرد.

استفاده از ماتريژل (ژل تهیه شده از پروتئینهای ماتريكس خارج سلولي) روش ديگري براي بررسي فعاليت ماتريكس متالوپروتئازهاست(16). اين ژل را به دو روش مختلف مي توان بكار برد. در يك روش از ماتريكس نشاندار شده با ماده راديو اكتيو استفاده مي شود. در اين روش سوسپانسيون سلولي را بر روي ماتريژل اضافه نموده و ميزان آزاد شدن مواد راديو اكتيو را در مايع روئي محيط كشت اندازه مي گيرند.

در روش ديگر سلولها را بر روي ماتريژل كشت داده و پس از مدت معيني ژل را از نظر ميزان نفوذ سلولها توسط ميكروسكوپ بررسي مي كنند. سلولهائي كه متالوپروتئازهای غشائی داشته باشند مي توانند بدنبال تجزيه پروتئينهاي ماتريكس در ژل نفوذ كنند. بقيه سلولها بطور عادي بر روي ژل رشد كرده  و داخل ژل وارد نمي شوند. با اين روش مي توان قدرت تهاجم (invasion) سلولهاي سرطاني را بررسي نموده و حضور متالوپروتئینازهای غشائی را نشان داد. اين آزمون در آینده ممكن است جهت تعيين قدرت متاستاز سلولهای سرطانی بکار گرفته شود (17-18-19-20).

يكي از ساده ترين روشهاي بررسي متالوپروتئازها سنجش مقدار آنها با استفاده از روشهاي ايمونولوژيك است (11-12). امروزه بر عليه اكثر آنزيمهاي فوق آنتي بادي مونوكلونال تهيه شده است. حتي بر عليه مهار كننده هاي اختصاصي متالوپروتئازها ، پروآنزيم ها و مجموعه هاي متالوپروتئاز متصل به مهار كننده نيز آنتي بادي اختصاصي تهيه شده است. به كمك اين آنتي بادي ها مي توان تستهايي نظير اليزا، راديوايمونواسي و وسترن بلات را طراحي كرده و براحتی مقدار کمی هر یک از پروتئازها یا مهارکننده های آنها را تعیین کرد. امروزه با روشهاي ايمنوهيستوشيميايي می توان محل حضور متالوپروتئاز خاصي را در بافت يا رده سلولی خاص نشان داده و بکمک روشهای پیشرفته بیولوژی مولکولی و ایمونوژنتیک نظیر Northern Blot و PCR كمي ميزان بيان هر یک از آنزیمهای فوق را تعیین نمود.

 

References:

1- R. Falak ;, Evaluation of MMPs in Allergic Contact Dermatitis. M.S. Thesis (2001). Tehran University of Medical Scinces, school of Medicine, Tehran, Iran.

2- M. R. Khorramizadeh et al; Dermal Wound Fibroblasts & MMPs : Their Posssible Role in Allergic Contact Dermatitis. Iranian J. Allergy, Asthma & Immunol. 2004; 3, 1, 7-11.

3- C.James et al; Proteases; structures, mechanism & inhibitors; Proteases, Protease Inhibitors and Protease-Derived Peptides, edited by J.C.Cheronis  et al, 1993.

4- R.I.Freshney; Disaggregation of the Tissue and Primary Culture. Culture of Animal Cells:a Manual of Basic Technique, 2nd edition, 1987, Chapter 9, pp.107-126.

5- A.J.Barret; Proteolitic Enzymes :Nomenclature and Classification. Proteolytic Enzymes, edited by R.Beynon et al, chapter 1, pp. 1-23.

6- G.S.Salvensen et al; Inhibition of Proteolytic Enzymes. Proteolytic Enzymes, edited by R. Beynon et al, chapter 5, pp. 105-131.

7 - A.J.P.Docherty et al; The MMPs and Their Natural Inhibitors :Prospects for Treating Degenerative Tissue Diseases. Tibtech, June 1992, Vol 10, pp.200-207.

8- P.D.Brown; Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Breast Cancer Research and Treatment, 1998, Vol 52, 125-136.

9- J.F.Woessner et al; Biological roles of the MMPs. Matrix Metalloproteinases and TIMPs: oxford university press 2000, pp. 126-127.

10- G.Sarath et al; Protease  Assay  Methods. Proteolytic Enzymes, edited by R.Beynon et al, chapter 3, pp. 45-77.

11- S.Cooksle etal; Immunoassays for Detection of Human Collagenases ,Stromelysins , TIMPs & Enzyme-Inhibitor Complexes. Matrix, 1990, Vol 10 , pp. 285-291.

12- S.Zucker et al; Measurement of Matrix Metalloproteinases and Tissue Inhibitors of Metalloproteinases in Blood and Tissues: Clinical and Experimental Applications. Annals of the New York Academy of Sciences, 878: 212-227, 1999.

13- J.F. Woessner et al; Protein Substrates of the MMPs. Matrix Metalloproteinases and TIMPs: oxford university press 2000, pp.87-97.

14- J.F.Woessner; Quantification of Matrix Metalloproteinases in Tissue Samples. Methods Enzymol. 248: 510-528.

15- Y.Okada; Proteinases & Matrix Degradation. Kelley’s Textbook of Rheumatology, edited by S. Ruddy et al, 2001, vol 1, chapter 4, pp. 55-73.

16- S.J.Fisher et al; The Catabolism of Extracellular Matrix Components. Extracellular Matrix: A Practical Appproach, edited by M.A.Haralson et al, 1995.

17- Z.S.Galis et al; Increased Expression of Matrix Metalloproteinases and Matrix Degrading Activity in Vulnerable Regions of Human Atherosclerotic Plaques. J Clin Invest. 1994 Dec: 94(6): 2493-2503.

18- A.Strongin; How are Collagenases Involved in Breast Cancer Metastasis? La Jolla Institute for Experimental Medicine, Research Project,1996–99.

19- K.Endo et al; Elevated Levels of Serum and Plasma Metalloproteinases in Patients With Gastric Cancer. Anticancer Research, 1997, Vol 17, 2253-2258.

20- - E.L.Deryugina et al; Tumor Cell Invasion Through Matrigel is Regulated by Activated MMP2.

Anticancer Res ,1997, Sep-Oct:17(5A):3201-10.

21- E.J.Goetzl et al; Matrix Metalloproteinases in Immunity. The Journal of Immunology, Vol 156, Issue 1, 1-4, 1996.

22- U.K.Saarialho-kere; Patterns of Matrix Metalloproteinases and TIMP Expression in Chronic Ulcers. Arch. Dermatology Res, 1996, Vol 290 (supply), pp. s47-s54.

23- M.Toi et al; Metalloproteinases and Tissue Inhibitors of Metalloproteinases. Breast Cancer Research and Treatment, 1998, Vol 52: 113-124.

24- G.Murphy et al; Gelatinases  A  and  B. Methods Enzymol. 248: 470-485.

25- G.Murphy et al; Tissue Inhibitors of Matrix Mettalloendopeptidases (TIMPs). Methods Enzymol. 248: 496-510.

26- M.Polette et al; Membrane-type Metalloproteinases in Tumor Invation. The International Jurnal of Biochemistry & Cell Biology, 1998, Vol 30, 1195-1202.

27- P.D.Brown; Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Breast Cancer Research and Treatment, 1998, Vol 52: 125-136.

28- L.L.Johnson et al;  Matrix Metalloproteinases. Curr-Opin-Chem-Biol. 1998 Aug: 2(4): 466-71.

+ نوشته شده در  Fri 22 Feb 2008ساعت 12 PM  توسط Reza Falak  | 

Anti-neutrophile Cytoplasmic Antibodies Application in Clinical Diagnosis

 

مروری بر كاربردهای باليني ANCA

آنتی بادیهای ضد سیتوپلاسم نوتروفیل اتوآنتي باديهاي مرتبط با واسكوليت و بيماريهاي التهابي مي باشند که اولین بار در سال 1982 در سرم بيماران مبتلا به گلومرولونفريت  نكروز دهنده ديده شدند. اگر محتويات گرانولهاي آزوروفیلیک نوتروفیلها را بر اساس وزن مولكولي جدا کنیم پروتئينهاي 29 و 140 كيلودالتونی مهمترین فراکسیونهائی هستند که بترتیب مربوط به آنزیمهای پروتئيناز3  و ميلوپرواكسيداز بوده و با اين اتوآنتی بادیها واكنش مي دهند. علاوه بر پروتئيناز3 و ميلوپرواكسيداز، آنتی ژنهای دیگری نظیر الاستاز، لاكتوفرين ، پروتئین افزاینده نفوذپذیری باکتری، دفنسينها، آزوروسيدين، كاتالاز، كاتپسين G ، ليزوزيم و غيره نيز در اين رابطه مطرح شده اند.

اولين روشي كه جهت جستجوي ANCA بكار رفت ايمنوفلورسانس غير مستقيم روي گرانولوسيتهاي فيكس شده با اتانول بود. با اين روش عمدتا دو الگوي رنگ آميزي سيتوپلاسمي يا C.ANCA و اطراف هسته يا P.ANCA مشاهده مي شود. بعد از ايمنوفلورسانس غير مستقيم روشهاي الايزا، کمی لومینسانس و غیره  با استفاده از مواد استخراج شده از گرانولوسيتها طراحی گردید. اين آزمايش كاربردهاي باليني زيادي دارد كه بطور خلاصه به بعضي از موارد مهم اشاره مي شود:

1- بيماريهاي كليوي: آزمايش ANCA در تشخيص نارسائيهاي كليوي با منشاء نامشخص اهميت فراواني دارد. در این بیماران احتمال تشخیص های افتراقی که نیاز به درمان با داروهای سرکوبگر ایمنی داشته باشند با توجه به علائم بالینی 5 تا 30 درصد است ولی اگر چنين اتوآنتي باديهايي در سرم این بیماران پيدا شود احتمال نياز به سركوب ايمني به بيش از 95 درصد افزايش مي يابد. زیرا در بيماريهايي نظير لوپوس اريتماتوز منتشر و گلومرولونفريت مزانژيوكاپيلاري كه ممكن است آزمايش ANCA بطور كاذب مثبت باشد سرکوب ایمنی مفيد است. پس از شروع درمان بخصوص در بیمارانی كه تيتر ANCA پاييني دارند بايستي نتايج آزمایشات با روشهاي اختصاصی تر تائيد شود. از طرف ديگر يك نتیجه ANCA منفي، بخصوص اگر آنتي باديهاي ضد غشاء بازال گلومرولي نيز همزمان منفی باشند احتمال وجود بیماریهائی كه نياز به سركوب ايمني دارد را مي كاهد. آندوكارديت سپتيك با گرفتاري كليوي ممكن است پاسخهاي مثبت كاذب دهد و مهمترين مورد تشخيص افتراقي می باشد كه نیاز به تجویز داروهای سرکوبگر ایمنی ندارد.

2- بيماريهاي التهابي سيستميك: آزمايش ANCA در تشخيص بيماريهاي التهابي با منشاء نامشخص نیز كاربرد زيادي دارد. تشخيص افتراقي شامل انواع مختلف عفونتها و بدخيميهاست كه استفاده از داروهاي سركوبگر ايمني باعث تشدید بیماری می شود. اختصاصيت بالاي آزمایش جهت تشخیص واسكوليتهاي سيستميك از حساسيت بالاي آن مهم تر است. بالاترين اختصاصيت با بکار گیری همزمان روشهای الايزا و ايمنوفلورسانس غير مستقيم بدست می آید.

3- بيماريهاي التهابي روده: گاهي تشخيص افتراقی بيماريهاي التهابي روده نظير كوليت اولسراتيو از بيماري كرون مشكل است. در هر دو مورد اتيولوژي ناشناخته بوده و التهاب مزمن روده را داريم. عمدتا تشخيص اين دو بيماري توسط علائم باليني داده می شود، ليكن پارامترهاي سرولوژيك نيز می تواند كمك كننده باشد. امروزه استفاده از ANCA جهت تشخيص كوليت اولسراتيو در حال بررسي است زيرا ANCA بخصوص X.ANCA يا Atypical.ANCA در 40 الي 60 درصد اين بيماران يافت می شود. در بيماري كرون آنتي باديهای ضد مانان ساكارومايسس سرويسيه  در 60 -70 درصد بيماران دیده می شود. بيماري که علائم بالینی التهاب روده دارد و P.ANCA مثبت است نسبت به فردي كه ASCA مثبت است احتمال كوليت اولسراتيو بيشتري دارد.

4- فيبروز سيستيك: فيبروز سيستيك يك بيماري ژنتيكي است كه با علائمی نظیر موكوس با ويسكوزيتي بالا و عفونتهاي مزمن ريوي شناخته می شود.ANCA  يك يافته نسبتاً شايع در فيبروز سيستيك بوده و عمدتا آنتی بادیهای ضد پروتئین افزاینده نفوذپذیری باکتری در آن دیده می شود. مطالعات اخير ارتباطي بين كلونيزه شدن مزمن سودوموناس و آنتی بادیهای ضد پروتئین افزاینده نفوذپذیری باکتری نشان داده اند. این اتوآنتي باديها با قسمت انتهاي كربوكسيل BPI كه در اپسونيزاسيون باکتریهاي گرم منفي نقش دارد واكنش داده و باعث مهار اپسونيزاسيون می شوند. يك ارتباط منفي بين تيتر آنتی بادیهای ضد پروتئین افزاینده نفوذپذیری باکتری  و عملكرد ريه دیده شده است. هنوز ارزش باليني ANCA در فيبروز سيستيك مشخص نیست ولی در آينده ممكن است از روشهاي درماني كه باعث كاهش توليد آنتي باديها مي شوند جهت درمان فيبروز سيستيك استفاده شود.

5- پيگيري سير درماني واسكوليتهاي مرتبط با ANCA : عود بيماري يكي از خصوصيات واسكوليتهاي سيستميك است كه حتي 15 سال بعد از شروع بيماري ديده شده است. در 50 درصد بيماراني كه واسكوليتهاي عروق كوچك مرتبط با anti-PR3 دارند تا 5 سال بعد حداقل يك بار عود بيماري رخ می دهد و مقادير كمتري در رابطه با بیماریهای مرتبط با anti-MPO ديده می شود. عود بيماري اغلب در بيماراني ديده می شود كه در دوره ركود بيماري، ANCA مثبت هستند. بطور كلي پس از يك بار افزايش قابل توجه تيتر ANCA احتمال عود بيماري طي 6 ماه بعد حدود 50 درصد می باشد. بيش از 90 درصد بيماران هنگام عود مجدد بيماري ANCA مثبت هستند. منفي بودن آزمايش ANCA علامت خوبي بوده و نشان می دهد كه بيماري تحت كنترل است.

6- دیالیز و پيوند كليه: يكي از عوارض شایع واسكوليت سيستميك اورمی است که ممکن است منجر به دیالیز یا پیوند کلیه شود. در طي درمان دياليزي تشخيص عود مجدد بيماري مشكل است زيرا علائم عمومي واسكوليت براحتي با علائم اورمي اشتباه می شود، بعلاوه از علائم اختصاصی نظیر هماچوری و افزایش کراتینین سرم نیز نمی توان استفاده کرد. بعلاوه در 5 درصد بيماران دياليزي فاقد علائم واسكوليت، آزمايش ANCA بروش ايمنوفلورسانس غير مستقيم مثبت است. با اينكه اورمي اثرات ايمنوساپرسيو دارد ولی سالانه حدود10 درصد بيماران دياليزي دچار عود بيماري می شوند. پس از پيوند كليه نيز در 20 درصد موارد عود بيماري ديده می شود. احتمالا پروتوكولهاي پيشرفته تضعيف ايمني كه جهت جلوگيري از رد پيوند بكار مي روند در جلوگيري از عود بيماري هم مؤثرند.

روش انجام آزمايش ANCA :

بطور كلي براي غربالگري ANCA روش ايمنوفلورسانس غير مستقيم مناسب است، زيرا فقط در موارد اندكي آزمايش ANCA بروش ايمنوفلورسانس غير مستقيم مثبت شده و بروش الایزا منفي خواهد بود، اما اكثر بيماران واسكوليت سيستميك بروش الایزا مثبت خواهند شد. اگر به واسكوليت سيستميك مشكوك باشيم آزمايش اليزا براي پروتئيناز 3 و ميلوپرواكسيداز انجام شده و نتايج مثبت گزارش می شود در صورتی که نتيجه منفي باشد بهتر است آنتي باديهاي ضد غشاء بازال گلومرولي بررسي شود زيرا سندرم گودپاسچر نیز علائم مشابهی دارد. در بيماران واسكوليت سيستميك و در پيگيري درمان بيماران روشهاي الایزای تسخيري عود بيماري را بهتر نشان می دهند. بجز آنتی بادیهای ضد پروتئيناز 3 و ميلوپرواكسيداز سایر آنتی بادیهای ضد سیتوپلاسم نوتروفیل دربيماران واسكوليت سيستميك ارزش محدودي داشته و عمدتا در ساير اختلالات التهابي نظير كوليت اولسراتيو، كرون، هپاتيت اتوايميون و غيره ديده می شوند و عمدتا ضد الاستاز، لاكتوفرين، پروتئین افزاینده نفوذپذیری باکتری ، كاتپسين G و غيره هستند.

 

References:

1-      Hagen EC, et al; J Immunol Methods 1993 Feb 26; 159(1-2): 1-16

2-      Wang G, et al; J Immunol Methods 1997 Oct 27; 208(2): 203-11

3-      Westman KW, et al; Kidney Int 1998 May; 53(5): 1230-6

4-      Hagen EC, et al; Kidney Int 1998 Mar; 53(3): 743-53

5-      Savige JA, et al ;J Clin Pathol 1998 Aug;51(8):568-75

6-      Wong RC, et al; J Clin Pathol 1999 Feb; 52(2): 124-8

7-      Radice A, et al; Clin Exp Rheumatol 2000 Nov-Dec; 18(6): 707-12

8-      Savige J, et al; Am J Clin Pathol 1999 Apr; 111(4): 507-13

9-      Galeazzi M, et al; Clin Exp Rheumatol 1998 Sep-Oct; 16(5): 541-6

10-   Reumaux D, et al ;Inflamm Bowel Dis 2000 Nov; 6(4):270-4

11-   Ara J, et al ;Nephrol Dial Transplant 1999 Jul;14(7):1667-72

12-   Kyndt X, et al; Am J Med 1999 May; 106(5): 527-33

13-   Schultz DR, et al ;Semin Arthritis Rheum 2000 Apr; 29(5):267-85

14-   Jethwa HS, et al ;Clin Exp Immunol 2000 Sep;121(3):544-50

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Key word:

1-       ANCA: Anti-neutrophile cytoplasmic antibodies

2-       PR3: Proteinase 3

3-       MPO: Myeloperoxidase

4-       Elastase

5-       Lactoferine

6-       BPI: Bactericidal permeability increasing protein

7-       Defensin

8-       Azurocidin

9-       Catalase

10-    Cathepsin G

11-    C.ANCA : Cytoplasmic ANCA

12-    P.ANCA : Perinuclear ANCA

13-    anti-GBM : Anti-Glomerular basement membrane antibody

14-    ASCA : Anti-saccharomyces cervisiae antibodies

+ نوشته شده در  Fri 22 Feb 2008ساعت 11 AM  توسط Reza Falak  | 

Hi there, here you may find my last article about breast cancer; (The Evaluation of Serum Levels of IFN-gamma, IL-12 and Percentage of CD4+, CD8+ and NK Cells in Peripheral Blood of Metastatic, Nonmetastatic Breast Cancer Patients and Normal Individuals) :

http://www.iums.ac.ir/ijs/jiums/browse.php?a_code=A-10-1-783&slc_lang=en&sid=1

+ نوشته شده در  Wed 20 Feb 2008ساعت 4 PM  توسط Reza Falak  |